Detección de Leifsnoia en caña de azucar y tratamientos (termoterapia vs electroterapia)

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Detección de Leifsonia xyli subsp. xyli en Caña de Azúcar (Saccharum spp.), Saneamiento Mediante Técnicas Biotecnológicas.

RESUMEN:

El raquitismo de los retoños (RSD), enfermedad producida por la bacteria Leifsonia xyli subsp. xyli, es una de las más generalizadas en las plantaciones cañeras y ocasiona notables pérdidas en el rendimiento agrícola. Una de las formas de combatirla es el tratamiento de la semilla para eliminar la bacteria del tejido, para lo cual se requiere de técnicas de saneamiento y un diagnóstico preciso para su detección, sobre todo como base para la producción de semilla por técnicas de propagación masiva. 

Este trabajo tuvo como objetivo el empleo de una técnica de diagnóstico sensible y masiva como el dot-blot, que permitió detectar la presencia del agente causal del RSD en materiales micropropagados por diferentes técnicas de saneamiento aplicadas para el control de dicho agente. 

Los resultados demuestran que la termoterapia y el cultivo de ápices meristemáticos, por sí solos, resultan ineficientes para la eliminación de este patógeno. Sin embargo, el uso de la electroterapia combinada con el cultivo de meristemo mostró posibilidades reales de obtener plantas sanas del 84-100% en Ja 60-5 y de un 25-80% en CP 52-43 utilizando (10, 15, 30 V por 5 min). 

El diagnóstico por dot-blot con un anticuerpo monoclonal de producción nacional en la detección de L. xyli subsp. xyli, con centrifugación de las muestras, previa a la colocación en la membrana de nitrocelulosa, resulta ser un protocolo adecuado para el análisis de un gran número de muestras que provienen de campo o que han sido tratadas durante el saneamiento.

INTRODUCCIÓN

La caña de azúcar (Saccharum spp.) es el principal cultivo económico de muchos países. Se encuentra entre los diez primeros para la producción de alimento y proporciona entre el 60 y 70% del azúcar que se elabora mundialmente (Ahlfeld, 1996).

Las enfermedades de la caña de azúcar constituyen uno de los principales factores negativos para la producción azucarera mundial. Durante los últimos años ha crecido considerablemente el número de organismos patógenos y agentes etiológicos detectados sobre este cultivo y se han extendido, de forma notable, los que existían con anterioridad. Hasta la fecha han sido informadas más de 126 enfermedades en unos 109 países y regiones cañeras. Por tal motivo, es de suma importancia dominar la situación fitosanitaria de las plantaciones cañeras para estar en condiciones de prevenir o reducir las pérdidas ocasionadas por enfermedades en las cosechas (Chinea et al., 2000).

El raquitismo de los retoños (RSD), una de las enfermedades más difundidas por las regiones cañeras del mundo, ocasiona cuantiosas pérdidas al cultivo de la caña de azúcar al reducir los rendimientos agrícolas hasta un 15-20% en caña planta; siendo mayores los deterioros en los retoños sucesivos. Por sus características aparentemente asintomáticas y su fácil forma de propagación, ha alcanzado una diseminación generalizada en las plantaciones cañeras.

La enfermedad es diseminada mecánicamente en los plantines pese al uso de termoterapia de los donantes. Dicha terapia reduce la incidencia, pero no erradica el agente. Por lo que aseguran que el uso de cultivares resistentes ofrecería las mayores posibilidades de manejo de la enfermedad.

2. Saneamiento por termoterapia

Se tomaron yemas de planta las que se dividieron en tres grupos aplicándosele los tratamientos siguientes:

Variante 1: Agua caliente a 50.5ºC por dos horas = 50 yemas.

Variante 2: Agua caliente a 50.5ºC por tres horas a dos yemas por planta = 50 yemas.

Variante 3: Cámara húmeda a 44ºC durante cuatro horas y seguidamente a 25ºC por cuatro horas más a yemas por planta = 50 yemas.

Una vez concluidos estos tratamientos se sembraron las yemas en cajas de poliespuma con suelo estéril para llevarlas a la ETICA, donde culminaron su desarrollo. Cuando crecieron se diagnosticaron, también por el procedimiento descrito.

3. Electroterapia y cultivo de ápices

Los tratamientos eléctricos fueron aplicados a partir de una fuente de corriente directa construida para el efecto (Hernández et al., 1995) (Fig. 2). Se midió la corriente eléctrica de salida en (miliamperes) y el voltaje aplicado (volt). Se trabajó con dos variedades de caña de azúcar (Ja 60-5 y CP 52-43), estudiándose tres tratamientos de voltajes constantes de 30, 15, 10 volts por 5 min, se incluyó un testigo sin tratar y se hicieron 30 replicas por cada variante. El procedimiento in vitro se efectuó según el método tradicional de extracción de meristemos. Posterior a la aplicación de corriente se establecieron 50 ápices/tratamiento con aproximadamente 0.7 cm de longitud en el medio de cultivo propuesto por Santana (1994) y luego se multiplicaron según Jiménez (1995). En experimentos previos se delimitó la sensibilidad de la corriente al tejido y se seleccionó qué parte de la planta sería tratada, así como que plantas debían proceder de campo o vitroplantas adaptadas a condiciones controladas con más de tres meses de transplante.

A los 30 días se evaluó el porcentaje de regeneración y después del primer subcultivo se tomaron 5 replicas de cada línea para el diagnóstico. Las copias de estas muestras negativas fueron enviadas al CENSA para su reconfirmación. Los resultados obtenidos fueron procesados mediante el análisis de comparación de proporciones que brinda el paquete estadístico STATGRAPHICS para Windows versión 4.1 con un nivel de significación del 95%.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Saneamiento por termoterapia

Ante los tratamientos térmicos efectuados a las yemas, los resultados de regeneración en el tratamiento con agua caliente a 50.5 ºC por tres horas fue de 0%, ya que al afectarse su germinación no se logró obtener ninguna planta y en el resto de los tratamientos fue de un 40% al obtenerse 16 plantas de las 40 yemas sembradas. Esta brotación es baja y coincide con los reportados en la literatura para tratamientos largos, dado que a medida que aumenta la temperatura disminuye la emergencia de yemas, así como la supervivencia de las plantas. Fitch et al. (2001) aclaran que los tratamientos con agua caliente no fueron satisfactorios para eliminar el virus, además de solo regenerar el 50% de las plantas tratadas. Asimismo, Pérez et al. (1998) reportan de un 30-44%, utilizando ese mismo tratamiento sobre propágulos de una yema de diferentes tamaños y diversas variedades

Al realizar el dot-blot se observó también una detección del 100% de RSD, no siendo efectivo el tratamiento térmico en ningún caso para la eliminación de Leifsonia xyli subsp. xyli (Fig. 6). Dichos resultados coinciden con los reportados por Ramallo & de Ramallo (2001), donde no obtuvieron saneamiento de RSD con el tratamiento hidrotérmico a 50.5 ºC/2 h aplicado a propágulos de una yema, en la mayoría de las variedades estudiadas, realizando la detección de la enfermedad mediante las técnicas de dot-blot e IFI, aunque lograron una atenuación de la bacteria. Resultados similares fueron obtenidos por investigadores de la EPICA de Jovellanos, Matanzas, Cuba, quienes no consiguieron erradicar el patógeno con ninguno de los tratamientos hidrotérmicos estudiados, incluyendo el de 50.5 ºC/2 h, pero si disminuyó la concentración de células de Leifsonia xyli subsp. xyli, según lo revelado por IFI (Pérez et al., 1998).

Por otra parte (Piñón, 2001) afirma que para controlar el RSD es necesario que la semilla comercial haya recibido como mínimo tres tratamientos de hidrotermoterapia sucesivos, además de aplicar las medidas de control adecuadas, pues con uno solo no se logra la inactivación total del organismo causal de la enfermedad. Young et al. (2006) aseguran que la termoterapia de las plantas donantes reduce la incidencia del RSD, pero falla en la erradicación de la enfermedad.

Fig. 6. Resultados del dot-blot en los tratamientos de termoterapia

Electroterapia y cultivo de ápices.

En la Fig. 7 se resumen los efectos de la corriente eléctrica sobre la regeneración de plantas de diferentes variedades. Se muestra una respuesta similar de ambas variedades ante los diferentes tratamientos, observándose una disminución de este parámetro al aumentar el voltaje.

Luego de la aplicación de la corriente eléctrica se observó una respuesta positiva en ambas variedades (Fig. 8). El porcentaje de plantas sanas fue mayor en todos lo tratamientos aplicados con respecto al testigo en ambas variedades. En Ja 60-5, no existieron diferencias en cuanto al saneamiento a RSD en las tres variantes empleadas, lográndose hasta un 100% de sanidad cuando se aplicaron 10 V/5 min. Mientras que en CP 52-43 hay una disminución de este parámetro, cuando se somete al explante a 30 V/5 min, existiendo una respuesta diferencial entre variedades para este tratamiento.

Las plantas electroterapiadas pueden ser afectadas por los excesos de corriente y por la duración de los tratamientos, disminuyendo la regeneración de los explantes y la efectividad de la terapia, por lo que debe buscarse una combinación optima para lograr una eficiencia adecuada (Hernández et al, 1997). Entre las alternativas utilizadas la aplicación 10 V/5 min fue la de mejores resultados, al combinar los mejores porcentajes de sanidad y regeneración, aunque no difieren mucho de lo logrado con 15 V/5 min, que es la que más se emplea en caña de azúcar. Esta técnica de saneamiento ha sido utilizada con alentadores resultados en varios cultivos para eliminar tanto virus como bacterias (Hernández, 1997).

Coincidiendo con Wagele (1978), en que con voltajes adecuados se logra una estimulación de los tejidos y se facilita su crecimiento más rápido y vigoroso, dicho crecimiento y organogénesis fue dependiente del tratamiento y del genotipo dado (Dawson, 1978; Golsworthy, 1987 citado por Hernández, 2000).

Otros investigadores como Matos (2002) informaron que la aplicación de 15 V/5 min producían la eliminación de escaldadura en un 100% en caña de azúcar con un 22% de sobrevivencia. Estos porcentajes demuestran las posibilidades reales de saneamiento con electroterapia, corroborando los trabajos publicados hasta la fecha por Blanchard (1974) en el ajo, Hernández et al. (1995), Lozoya et al. (1996) y Bernal (1997) en la papa y finalmente, Hernández et al. (2002) en el banano.